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門頭溝細胞內的物質運輸系統實驗步驟之細胞轉染!

作者: 發布時間:2022-07-02 21:05:59點擊:3866

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細胞內的物質運輸系統實驗步驟之細胞轉染!
細胞轉染(transfection)暨蛋白質外釋作用:VSVG-GFP與ARLI-QL質體(plasmid)共同轉染
1. 取4×104個COS-7細胞至12-well plate的單一培養井(well)中,經隔夜培養約16~24小時。
2. 取100μl OPTI-MEN(ㄧ種不含胎牛血清的培養液)及0.5μg ARL1QL質體、0.5μg VSVG-GFP質體混合,取100μl OPTI-MEN 及1μl lipofectamin(ㄧ種脂小體)混合,將二者均勻混合,靜置30分鐘。
3. 取出原培養液,并加入100μl OPTI-MEN至每一個培養井后,將含有ARL1QL、VSVG-GFP及脂小體的混合液加入培養井,放入二氧化碳培養箱5小時。
4. 抽出混合液,更換正常之培養液(含10% FBS(胎牛血清)/DMEM),繼續培養36-48小時。
5. 取出細胞培養盤后,以 PBS 清洗一次,再以濃度4 % 的福馬林進行固定15分鐘。
6. 以PBS清洗一次,加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清潔劑,靜置15分鐘,以增加細胞膜的通透性。
7. 以PBS清洗二次,加入含有saponin、BSA的阻斷緩衝液,靜置30分鐘,以阻斷抗原與抗體間非專一性的結合。
8. 取出阻斷緩衝液后,加入抗ARL1的抗體(來自兔子的多株抗體;一級抗體),靜置30分鐘。
9. 以 PBS 清洗四次,加入含有螢光標定的二級抗體(抗兔子之免疫球蛋白,來自山羊;紅光),以及 DNA 染劑 Hochest33258,靜置30分鐘。
10. 以PBS清洗四次,待自然風乾后,于載玻片上滴入封片液,進行封片。
11. 以螢光顯微鏡觀察標示蛋白質在細胞內的分布情形。
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