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細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)步驟之!
（二）蛋白質(zhì)內(nèi)胞作用一：霍亂毒素次單元B （Cholera Toxin subunit-B；CTB-594 nm；紅光）之運(yùn)輸
1. 取4×104個(gè)COS-7細(xì)胞至12-well plate的單一培養(yǎng)井（well）中，經(jīng)隔夜培養(yǎng)約16~24小時(shí)。
2. 取出培養(yǎng)液，加入含有螢光標(biāo)定的CTB，濃度為1μg/μl，體積200μl至每一個(gè)培養(yǎng)井內(nèi)，并置入攝氏4度的冰箱10分鐘。
3. 將細(xì)胞自冰箱取出，立刻放入二氧化碳培養(yǎng)箱，溫度攝氏37度，二氧化碳濃度5 %，30分鐘，促使 CTB 能從細(xì)胞膜運(yùn)送至高基氏體處。
4. 取出后，以PBS清洗一次，再以濃度4 % 的福馬林進(jìn)行固定15分鐘。
5. 以 PBS 清洗一次，加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清潔劑，靜置15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性。
6. 以 PBS 清洗二次，加入含有皂素（saponin）、牛血清白蛋白質(zhì)（Bovine Serum Albumin；BSA）的阻斷緩衝液，靜置30分鐘，以阻斷抗原與抗體間非專一性的結(jié)合。
7. 取出阻斷緩衝液后，加入含有抗高基氏體標(biāo)示蛋白質(zhì)Golgin-245的抗體（來自老鼠的單株抗體；一級抗體），靜置30分鐘。
8. 以 PBS 清洗四次，加入含有螢光標(biāo)定的二級抗體（抗老鼠之免疫球蛋白；綠光），以及 DNA 染劑 Hochest33258，靜置30分鐘。
9. 以 PBS 清洗四次，待自然風(fēng)乾后，于載玻片上滴入封片液，進(jìn)行封片。
10. 以螢光顯微鏡觀察標(biāo)示蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布情形。
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